“非常期待這款工具能得到深入應(yīng)用，目前已經(jīng)有好幾個實驗室找我們要這個工具。”湘湖實驗室李果研究員表示。
日前，他和合作者發(fā)現(xiàn)了極小型 Cas13j 蛋白，并實現(xiàn)了高效的體內(nèi) RNA 編輯。
無論是對于生物多樣性的展現(xiàn)，還是對于新型 RNA 工具的開發(fā)與應(yīng)用，本次成果都具有重要意義。
在遺傳疾病治療上，在合成生物學(xué)的細(xì)胞工廠調(diào)控上，乃至于在農(nóng)業(yè)生物技術(shù)上，這種新型 Cas13j 技術(shù)都具有重要的應(yīng)用價值。
李果表示，新型 Cas13j 最大的特點便是小型化。目前，在自然狀態(tài)之下最小的 ChiCas13j 包含 424 個氨基酸。
通過截短處理之后，可以將氨基酸進(jìn)一步縮小到 340 個，這也意味著它是目前公開報道中最小的 Cas13 蛋白。
基于這一蛋白所構(gòu)建的 RNA 堿基編輯器，不僅僅體型非常小，而且效率非常高。
本次研究中，課題組已將其成功用于小鼠個體內(nèi)的 CU 單堿基編輯，為 RNA 編輯的治療提供了新工具。
無論是基于 CRISPR-Cas13 系統(tǒng)的抗病毒研究，還是基于 RNA 單堿基編輯器的疾病位點修復(fù)治療，Cas13j 都展現(xiàn)出不錯的優(yōu)勢。
2018 年，李果開始在中國農(nóng)業(yè)大學(xué)讀博，師從于該校的胡曉湘教授。該團(tuán)隊的研究方向之一是基于基因編輯技術(shù)的大動物模型制備。
她安排第一個課題是讓李果去開發(fā)高效的多基因編輯工具，以用于動物模型的快速制備。
2018 年底，李果被導(dǎo)師安排到上海科技大學(xué)黃行許教授團(tuán)隊學(xué)習(xí)基因編輯技術(shù)，自此開始了將近三年的聯(lián)合培養(yǎng)。
來到上海科技大學(xué)快一個月的時候，李果做了一次關(guān)于 RNA 病毒的組內(nèi) Journal Club。
通過大家的交流討論，他了解到 RNA 病毒給人類帶來的危害，也了解到在“中心法則”這個承上啟下的重要階段里 RNA 的世界是多么的豐富。
“隨即，我就和黃老師確定要做 RNA 編輯工具開發(fā)與應(yīng)用的課題方向?！崩罟硎?。
和 DNA 不同的是，RNA 更加豐富多變，同時在疾病治療上基于 RNA 編輯的治療也更加安全，脫靶風(fēng)險相對較小。
因此，李果非常看好 RNA 編輯治療的應(yīng)用前景。隨后，他和合作者也發(fā)了幾篇關(guān)于 RNA 編輯工具優(yōu)化改造與應(yīng)用的論文。
基于 RESCUE 的特性，李果和同事相繼開發(fā)了編輯效率更高的 eRESCUE、以及開發(fā)了脫靶率更低的 ecRESCUE 編輯器。
同時，他們與復(fù)旦大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻喉科舒易來教授團(tuán)隊合作，構(gòu)建了單點突變顯性致病耳聾模型鼠的 RNA 編輯治療新方法，從而將 CRISPR-CasRx 系統(tǒng)成功用于貝多芬鼠的耳聾治療研究。
目前，國內(nèi)已經(jīng)報道的基于 CRISPR-Cas13 系統(tǒng)的 RNA 編輯工具，仍然面臨著三大挑戰(zhàn)：
首先，不夠小型化?，F(xiàn)有的 Cas13 的 RNA 編輯器由于分子尺寸過大，導(dǎo)致遞送效率低。
其次，效率不夠高。基于 Cas13 的 RNA 編輯技術(shù)的高效性和精準(zhǔn)性依然欠佳。
再次，不夠新穎。當(dāng)下國內(nèi)依舊十分缺乏具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新型 Cas13 蛋白。
通過對微生物大規(guī)模宏基因組數(shù)據(jù)開展計算分析，來挖掘微小型的 Cas13 蛋白。
目的就是希望能夠開發(fā) 1-2 種具有中國自主知識產(chǎn)權(quán)的微小型 RNA 高效基因編輯底層技術(shù)，并至少構(gòu)建一種基于微小型 RNA 編輯工具的遺傳性疾病治療方案。
盡管此前領(lǐng)域內(nèi)也有多個基于新型 Cas 蛋白的“挖掘類成果”，但是它們所使用的數(shù)據(jù)來源于美國國家生物技術(shù)信息中心的公眾數(shù)據(jù)庫。
這時，李果等人注意到浙江大學(xué)科創(chuàng)中心的馬斌教授團(tuán)隊，了解到后者主要從事土壤微生物種質(zhì)資源分析的工作。
多年來，馬斌課題組針對土壤微生物基因組，開展了一系列的測序、組裝和注釋工作，構(gòu)建了基于土壤微生物的宏基因組數(shù)據(jù)庫。
李果等人和馬斌團(tuán)隊溝通之后，后者表示對于新型 CRISPR 系統(tǒng)的挖掘工作也非常感興趣。于是，雙方聯(lián)合開展了針對微小型 CRISPR-Cas13 系統(tǒng)的挖掘工作。
分析之后發(fā)現(xiàn)，在大量的土壤微生物宏基因組數(shù)據(jù)庫中，他們所關(guān)注的只是冰山一角，還有更多有意思的成分包括其他的抗菌肽、塑料降解酶、CRISPR-Cas 系統(tǒng)和互作功能因子等。
這些新的功能蛋白，不僅能用于開發(fā)新型工具，同時還能用于研發(fā)新的轉(zhuǎn)化產(chǎn)品。
為了解決遞送上的瓶頸問題，他們將研究重點聚焦于微小型 Cas13 蛋白的發(fā)現(xiàn)上。
期間，李果等人和合作者經(jīng)過多次溝通之后，最終選擇了馬斌團(tuán)隊組裝好的一個土壤微生物宏基因組數(shù)據(jù)庫。
然后，在這些序列之中，他們針對已知 Cas 蛋白加以檢索，借此證實了數(shù)據(jù)庫的有效性、以及分析方法的通用性。
接著，李果等人開始挖掘數(shù)據(jù)以及開展實驗。對于 Cas13 蛋白的智能挖掘來說，主要分為以下三步：
在實驗部分，李果和合作者先是針對微小型 Cas13 蛋白開展進(jìn)化分析與功能驗證。
在撰寫論文的同時，李果等人還將論文的主體部分分成“一種 VI-J 型 CRISPR-Cas13 基因編輯系統(tǒng)及其應(yīng)用”與“一種超小型 RNA 堿基編輯器及其應(yīng)用”兩個板塊進(jìn)行了專利申請。
李果表示：“記得研究剛開始的時候，我們團(tuán)隊的程亞仙博士（論文并列第一作者）對我算是極度的不信任，曾經(jīng)因為一個質(zhì)粒信息的偏差，一大早就對睡眼惺忪的我瘋狂輸出了一頓，哈哈?！?/p>
但是，在接下來的日子里他們彼此真誠相待?！拔覀兛梢宰鰧嶒炞龅胶芡恚部梢云鸬煤茉?，也可以沒有周末，會因為一個流式結(jié)果開心一下午。”李果說。
最終，他們一起攜手完成兩個項目，期間他們選擇相信彼此，在成為好朋友的同時，也成為了最好的實驗搭檔。
“可能整個‘五一’節(jié)大家都是在忐忑中度過的。當(dāng)收到論文被接受的郵件的那一刻，腎上腺素快速分泌的感覺至今難忘，大家都非常開心與激動?！崩罟硎尽?/p>
李果是共同一作兼共同通訊，浙江大學(xué)程亞仙博士是共同一作，浙江大學(xué)的姚遠(yuǎn)教授、馬斌研究員和陳學(xué)新教授擔(dān)任共同通訊作者 [1]。
如前所述，在本次研究之中該團(tuán)隊針對新型 Cas13j 蛋白做了各種優(yōu)化與 RNA 編輯器改造，同時也將其成功用于體內(nèi) RNA 編輯治療。
盡管 CRISPR-Cas13j 在 RNA 的精確編輯上展現(xiàn)出一定優(yōu)勢，但是依舊停留在實驗室水平。
一方面，李果等人將基于 Cas13j 蛋白進(jìn)一步地優(yōu)化工具，并打算解析 Cas13j 的蛋白結(jié)構(gòu)，以便更加細(xì)致地闡明它的工作機(jī)制，從而能夠更好地用于后期的優(yōu)化改造。
另一方面，李果等人也正在探索將 CRISPR-Cas13j 用于農(nóng)業(yè)動物的疫苗研發(fā)、抗 RNA 病毒育種、結(jié)合疾病位點的臨床治療等。
“這就需要更多人來使用和驗證我們的工具，因此期待更多學(xué)者可以和我們一起合作，充分發(fā)揮 Cas13j 蛋白的優(yōu)勢。”李果說。
他繼續(xù)說道：“近年來，AI 技術(shù)正在變革生命科學(xué)的研究范式，其實我們團(tuán)隊很早就關(guān)注了 AI 技術(shù)的發(fā)展?！?/p>
之前，他們曾嘗試使用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對抗學(xué)習(xí)（Protein-GAN）系統(tǒng)去研發(fā)新型 RNA 編輯工具，希望能夠?qū)?APOBEC 脫氨酶與 TadA 進(jìn)行賦能，從而構(gòu)建多功能的新型 RNA 編輯器。
同時，他們也嘗試過基于 Protein-GAN，來以人工方式生成新的 Cas 蛋白。
“雖然這些論文我們都沒有發(fā)表，但這些嘗試讓我們更加堅定要做好 IT 和 BT 的融合?！?/p>
事實證明，ChatGPT 大數(shù)據(jù)模型的出現(xiàn)，讓他們將上述兩種嘗試變成了現(xiàn)實。九游體育
